顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡(jiǎn)述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對(duì)應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。
1．透射光明視野：
基本部件： a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。注意事項(xiàng)： a. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場(chǎng)光闌不可任意開(kāi)大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會(huì)降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫(kù)勒照明系統(tǒng)； d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。
2．透射光相差法：
這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法。基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對(duì)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。
調(diào)整方法：
a. 在庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰
b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤(pán)刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品
c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）
d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合
e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像
f. 有20×和40×物鏡觀察時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。
適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細(xì)胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。
3．微分干涉相襯法：
為了克服相差法觀察時(shí)樣品細(xì)節(jié)像周圍伴隨有光暈，會(huì)掩沒(méi)掉本來(lái)應(yīng)該看見(jiàn)的細(xì)節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當(dāng)薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計(jì)子微分干涉相襯法。
調(diào)整方法：
a. 必須在庫(kù)勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法
b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置
c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東—西方向
d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)到與10×物鏡對(duì)應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3—0.4
e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）
f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南—北方
g. 換上待觀察的透明樣品，開(kāi)亮光源把樣品調(diào)焦清晰
h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達(dá)到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯
i. 同時(shí)可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達(dá)到最佳
j. 然后再細(xì)微調(diào)樣品的細(xì)節(jié)，可見(jiàn)樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)
k. 如果把補(bǔ)色器（first order red retardation plate）插入，并同時(shí)調(diào)節(jié)DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達(dá)100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細(xì)胞、小生生物等。
4．落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）：
簡(jiǎn)稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來(lái)的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長(zhǎng)較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波長(zhǎng)，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們*的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出*熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。
① 汞燈的安裝：
a. 打開(kāi)包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對(duì)向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)
b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定
c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。
d. 詳細(xì)的安裝方法請(qǐng)參照有關(guān)說(shuō)明書(shū)。
② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：
a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min
b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對(duì)地高度一樣的水平線作為參考線
c. 轉(zhuǎn)動(dòng)燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上
d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。
③汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：
a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場(chǎng)光闌開(kāi)到最大
b. 把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼
c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺(tái)上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙
d. 取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì)有一藍(lán)色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。
e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過(guò)目鏡可見(jiàn)白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光
f. 仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見(jiàn)而很容易調(diào)焦清晰。
④汞燈使用注意事項(xiàng) 通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對(duì)鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個(gè)大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。
a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時(shí)間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電
b. 汞燈在使用過(guò)程中，不要隨意開(kāi)關(guān)汞燈的電源
c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時(shí)，將會(huì)造成嚴(yán)重后果。由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未*液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強(qiáng)大的電流，輕則燒斷保險(xiǎn)絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會(huì)炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件。
d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當(dāng)可達(dá)600h，使用壽命與開(kāi)關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價(jià)格及昂貴，應(yīng)珍惜使用。
e. 汞燈壽命終結(jié)的標(biāo)志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。
5．暗視野法（dark field）：
許多透明或半透明的樣品，如細(xì)菌、微生物、細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細(xì)節(jié)。普遍光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為0.2μm，而暗視野顯微鏡雖然對(duì)樣品的細(xì)節(jié)構(gòu)造分辨不清楚，但卻可看到0.004μm以上微細(xì)顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來(lái)觀察微細(xì)的顆粒與細(xì)菌等。調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時(shí)須先用明視野聚光鏡把庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好。換上暗視野聚光鏡時(shí)，要把載玻片（樣品）移開(kāi)，將浸沒(méi)油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺(tái)上，浸沒(méi)油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過(guò)光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進(jìn)入聚光鏡內(nèi)。對(duì)于配備齊全的相差顯微鏡，與編號(hào)為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。
